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HydroCellTMをもちいた軟寒天コロニーアッセイ代替法(メチルセルロース法)について

メチルセルロースを用いたコロニーアッセイ(パンフレット掲載NRK細胞、A549細胞を用いた抗ガン合いスクリーニング例)のご紹介

増粘剤としてメチルセルロースを添加しています。0.6%程度の低濃度ではハンドリングに影響が少なく、培養が安定化し、細胞同士が浮遊中に接着し合い大きな塊を作ることを防ぐことができます。これにより、中心部の栄養不足によるネクローシスや接着におる増殖阻害を起こさず、本来の増殖能を反映した精度の高い測定が可能となります。

手順

  1. ガン細胞またはガン細胞を含む組織分散懸濁液を0.6%メチルセルロースを含む培養液に懸濁する。
  2. 細胞密度が10,000個/cm2以下になるようにHydroCellTMに播種する。(3,000個/cm2が好ましい)。
  3. 3日間、5%炭酸ガスインキュベータにて培養する。
  4. 培養像を写真にとり、生細胞測定試薬を添加し、数時間後にOD測定を行う。

メチルセルロース調整方法

使用するもの

  1. メチルセルロース 400cps (Wako,Cat#138-05052)
  2. 2倍濃縮した培地

0.6%メチルセルロース溶液の調整手順 概要

2.6%メチルセルロース溶液を調整し、その後0.6%へ希釈する。

A)2.6%メチルセルロース溶液の調整

  1. メチルセルロース(2.6g)を80〜90℃の精製水(25mL)に徐々に添加し、激しく振とうして十分に溶解させる。
  2. この溶液に4℃の精製水(75mL)を加え、激しく振とうした後、4℃以下で3時間以上、液が半透明になるまでマグネチックスターラーで撹拌する。
  3. 液を121℃、10分オートクレーブ滅菌する。
  4. 滅菌済液を4℃以下、24時間以上保存し、透明な状態にする。

B)1.3%メチルセルロースー培地混液の調整

2.6%メチルセルロース溶液に、2倍濃縮(×2)MEM(必要ならば、FCS等、血清とともに)を等量添加する。使用前、この混液を室温下で数時間、マグネチックスターラーを用いて撹拌する。

Bの溶液と組織分散懸濁液を用いて、最終濃度0.6%メチルセルロースー細胞混液を調整し、播種します。
培地につきましてはご参考とし、お客様の培地にあわせて手順内容をご調整ください。

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